Curso de Genômica Humana | ICC Fiocruz

Revisão teórica

Sat, 17 Feb 2024 00:00:00 +0000

Controle de Qualidade Pré-mapeamento

Arquivos FASTQ

Um arquivo FASTQ é o formato padrão para armazenar sequências de leitura brutas de sequenciamento de nova geração (NGS), como as geradas por plataformas Illumina. Ele contém não apenas a sequência de nucleotídeos lida, mas também uma pontuação de qualidade para cada base, permitindo a avaliação da confiabilidade dos dados.

Estrutura de um arquivo FASTQ.

Estrutura de um arquivo FASTQ

Cada leitura em um arquivo FASTQ é composta por quatro linhas:

1. Linha de Identificação (Header):
Começa com @ seguido por um identificador único da leitura (ex: ID do instrumento, número da corrida, coordenadas no flowcell).

#Exemplo:
@M02568:1:000000000-A227B:1:1101:17540:2009 1:N:0:1

2. Linha da Sequência:
Contém a sequência de nucleotídeos (A, T, C, G e N para bases incertas).

#Exemplo:
GTTTCCCCTCGCTGCGAAGGGCCGTCCGAGCGAAGCCGCAGGGTTTCAGCCATGGC

3. Linha Separadora:
Começa com + e pode opcionalmente repetir o identificador da leitura. Geralmente, é usada apenas para separar a sequência da linha de qualidade.

#Exemplo:
+

4. Linha de Qualidade (Phred Score):
Contém uma string de caracteres ASCII que representam a pontuação de qualidade Phred para cada base na linha de sequência correspondente. Uma pontuação mais alta indica uma maior confiança na base.

#Exemplo:
AAFFFJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ

Artigo que sistematizou a estrutura do arquivo FASTQ.

FastQC

O FastQC é uma ferramenta essencial para a análise inicial da qualidade de arquivos FASTQ. Ele gera um relatório detalhado que sumariza diversas métricas de qualidade das leituras brutas, permitindo identificar potenciais problemas antes do mapeamento.

Como funciona:

O FastQC analisa um ou mais arquivos FASTQ e produz um relatório HTML com gráficos e tabelas para cada uma das seguintes métricas:

Exemplo de relatório de qualidade gerado no FastQC a partir de um arquivo FASTQ.

Qualidade por Base (Per base sequence quality):
Mostra a distribuição das pontuações de qualidade Phred em cada posição das leituras. Quedas na qualidade em determinadas posições (especialmente no final das leituras) são comuns e importantes de serem observadas.
Qualidade por Leitura (Per sequence quality scores):
Apresenta a distribuição das pontuações médias de qualidade para todas as leituras. Ajuda a identificar se uma grande proporção das leituras possui baixa qualidade geral.
Conteúdo de GC por Leitura (Per base GC content):
Exibe a porcentagem de bases Guanina e Citosina em cada posição da leitura. Desvios significativos do esperado (com base no organismo) podem indicar contaminação ou viés de sequenciamento.
Conteúdo de GC por Sequência (Per sequence GC content):
Mostra a distribuição do conteúdo de GC médio para todas as leituras.
Deduplicação de Sequências (Sequence Duplication Levels):
Estima a proporção de leituras duplicadas, que podem ser um indicativo de super-amplificação por PCR.
Conteúdo de Adaptadores (Adapter Content):
Detecta a presença de sequências de adaptadores de sequenciamento, que precisam ser removidas no pré-processamento.
Conteúdo N (N Content):
Indica a porcentagem de bases “N” (bases não identificadas) em cada posição. Um alto percentual de Ns pode indicar problemas no sequenciamento.

Cada métrica é sinalizada com um status (Normal, Aviso ou Falha), facilitando a identificação de áreas problemáticas.

Documentação detalhada do FastQC.

MultiQC

Embora o FastQC seja excelente para relatórios individuais, a análise de centenas ou milhares de amostras seria impraticável. É aqui que o MultiQC se torna indispensável.

Como funciona:

O MultiQC é uma ferramenta que agrega e sumariza os relatórios de controle de qualidade de múltiplas amostras, gerados por diversas ferramentas de bioinformática (incluindo FastQC, SAMtools, GATK, Trimmomatic, BWA, entre outras). Ele lê os arquivos de saída dessas ferramentas e os consolida em um único relatório HTML interativo.

Exemplo de relatório de qualidade gerado no MultiQC a partir de vários arquivos FASTQ.

Vantagens do MultiQC:

Visão Geral Consolidada:
Em vez de abrir dezenas ou centenas de relatórios FastQC individualmente, o MultiQC apresenta todas as métricas em um único dashboard, facilitando a comparação entre amostras.
Detecção de Outliers:
Permite identificar rapidamente amostras com problemas de qualidade que se destacam do restante do conjunto de dados.
Interatividade:
O relatório HTML gerado pelo MultiQC é interativo, permitindo que o usuário explore gráficos, filtre amostras e visualize detalhes específicos de cada métrica.
Suporte a Múltiplas Ferramentas:
Além do FastQC, o MultiQC pode integrar resultados de outras etapas do pipeline, como o mapeamento (BWA-MEM), o processamento de BAM (SAMtools), e a chamada de variantes (GATK), fornecendo uma visão holística do controle de qualidade de todo o fluxo de trabalho.

Documentação detalhada do MultiQC.

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Depois do FASTQ […] Antes do VCF

Após o controle de qualidade dos arquivos FASTQ, os dados de sequenciamento são mapeados na sequência do genoma humano de referência (GRCh38 / HG38 ou GRCh37/HG19). O arquivo de resultado dos alinhamentos das leituras que estão nos arquivos FASTQ é colocado no formato SAM (Sequence Alignment Map).

Estrutura de um arquivo SAM.

Devido ao grande volume de dados ocupado por esse formato, transforma-se e trabalha-se com sua versão binária BAM (Binary Alignment Map), para todas as etapas de controle de qualidade pós mapeamento que antecedem a chamada e genotipagem de variantes genéticas.

Após a chamada de variantes genéticas e genotipagem conjunta (joint calling), as variações genotípicas em divergência com o genoma de referência são anotadas no padrão do formato VCF (Variant Call Format).

Arquivo VCF

É o formato padrão para armazenar informações sobre variantes genéticas (SNPs, INDELs e outras).

Estrutura de um arquivo VCF.

Colunas Essenciais do formato VCF

CHROM: Cromossomo onde a variante está localizada.
POS: Posição inicial da variante no cromossomo.
ID: Identificador da variante (ex: rsID do dbSNP, se disponível).
REF: Alelo de referência na posição.
ALT: Alelo(s) alternativo(s) observado(s).
QUAL: Escore de qualidade Phred para a chamada da variante.
FILTER: Indicação se a variante passou pelos filtros de qualidade.
INFO: Campo de informações adicionais sobre a variante (densamente anotado).
FORMAT: Define a ordem e o tipo de dados para cada amostra.
Colunas de Amostras: Contêm os genótipos e outros dados específicos da amostra.

Interpretação dos Genótipos

0/0 - Homozigoto para o alelo de referência.
0/1 - Heterozigoto (um alelo de referência e um alelo alternativo).
1/1 - Homozigoto para o alelo alternativo.
./. - Genótipo não chamado (leituras insuficientes ou de baixa qualidade).

Campo INFO

Contém as diversas anotações sobre cada variante, como:

QD (Quality by Depth): Escore de qualidade normalizado pela profundidade de cobertura.
FS (FisherStrand): Escore para viés de strand.
MQ (MappingQuality): Qualidade de mapeamento das leituras de suporte.

Anotadores

Anotadores, como exemplo o ANNOVAR, podem agregar informações de contexto genômico ao campo INFO do VCF:

Anotações funcionais: gene, tipo de variante genética, mudança de aminoácido (caso missense), etc.
Frequências populacionais (gnomAD, 1000 Genomes, ABraOM).
Classificações de patogenicidade (ClinVar, REVEL, CADD).

Visualizando dados com a linguagem R

O que é a Linguagem R?

R é uma linguagem de programação e um ambiente de software livre, amplamente utilizado para computação estatística e gráficos. É uma ferramenta poderosa para:

Processamento de Dados: Importar, limpar, transformar e organizar grandes conjuntos de dados.
Análise Estatística: Realizar uma vasta gama de análises estatísticas, desde testes simples a modelos complexos.
Visualização de Dados: Criar gráficos de alta qualidade para explorar e apresentar resultados de forma eficaz.

Por que R na Bioinformática?

No contexto da bioinformática, R é ideal para:

Processar e analisar dados de sequenciamento (genômica, transcriptômica, etc.).
Realizar análises de expressão diferencial.
Interpretar e visualizar resultados de anotação de variantes genéticas.
Desenvolver modelos preditivos para características biológicas ou doenças.
Realizar análises estatísticas.

O que é RStudio?

Enquanto R é a linguagem e o ambiente de execução, o RStudio é um Ambiente de Desenvolvimento Integrado (IDE) que facilita a escrita, execução e depuração de códigos R. Pense nele como uma “central de comando” que torna a experiência com R muito mais amigável e produtiva.

Principais funcionalidades do RStudio:

Editor de Código: Onde você escreve e edita seus scripts R. Oferece recursos como realce de sintaxe e autocompletar.
Console: Onde os comandos R são executados e os resultados são exibidos.
Ambiente: Mostra todos os objetos (variáveis, dados, funções) que você criou na sessão atual.
Arquivos, Plots, Pacotes, Ajuda, Viewer: Painéis dedicados para gerenciar arquivos, visualizar gráficos gerados, instalar e carregar pacotes, acessar a documentação e pré-visualizar arquivos HTML.

Programação com Pacotes em R

Uma das maiores forças do R é sua vasta coleção de pacotes. Um pacote é um conjunto de funções, dados e documentação pré-escritos que estendem as capacidades básicas do R.

Como funcionam os pacotes:

Instalação: Antes de usar um pacote pela primeira vez, você precisa instalá-lo. Isso geralmente é feito com o comando install.packages("nome_do_pacote"). Pense nisso como “baixar” uma nova ferramenta para sua caixa de ferramentas R.
Carregamento: Após a instalação, para usar as funções de um pacote em uma sessão R, você precisa “carregá-lo” usando o comando library(nome_do_pacote). Isso torna as funções do pacote disponíveis para uso.
Uso: Uma vez carregado, você pode chamar as funções do pacote diretamente em seu script.

Exemplos de pacotes comuns e suas aplicações na bioinformática:

dplyr: Essencial para manipulação e transformação de dados (filtrar, selecionar, agrupar, etc.).
ggplot2: O pacote padrão e mais robusto para a criação de gráficos estatísticos de alta qualidade e altamente personalizáveis.
vcfR: Específico para bioinformática, permite ler, manipular e visualizar arquivos VCF (Variant Call Format).
stringr: Facilita a manipulação de strings (textos), útil para extrair informações de anotações de variantes.

Ao utilizar pacotes, você não precisa “reinventar a roda” para cada tarefa. A comunidade R já desenvolveu e disponibilizou ferramentas otimizadas para diversas finalidades, permitindo que você se concentre na análise e interpretação dos seus dados.

Próximo passo

Agora que revisamos os fundamentos das métricas de qualidade de arquivos de sequenciamento de DNA, siga para a prática:

Mão na Massa!

Prática I

Mon, 01 Jan 0001 00:00:00 +0000

Análise de arquivos FASTQ

Nesta seção prática, vamos utilizar as ferramentas FastQC e MultiQC para analisar a qualidade de arquivos FASTQ de exemplo.

Os arquivos FASTQ estão localizados no diretório ~/data/fastq/ no servidor.

Objetivos:

Gerar relatórios de qualidade para arquivos FASTQ individuais usando FastQC.
Consolidar múltiplos relatórios FastQC em um único relatório interativo usando MultiQC.
Interpretar os resultados para identificar potenciais problemas de qualidade.

Passo-a-passo

01: Navegar até o diretório dos arquivos FASTQ

Primeiro, acesse o diretório onde seus arquivos FASTQ estão armazenados.

cd /home/USERNAME/Desktop/curso_de_inverno/quarta/fastq

02: Executar FastQC para cada arquivo FASTQ

Para cada arquivo FASTQ, execute o FastQC individualmente. O FastQC criará um arquivo .html e um arquivo .zip para cada FASTQ no mesmo diretório.

fastqc Exoma001.fastq.gz

fastqc Exoma002.fastq.gz

# Repita para todos os arquivos FASTQ que você deseja analisar!

03: Executar MultiQC para consolidar os relatórios

Após executar o FastQC para todos os seus arquivos, execute o MultiQC no diretório que contém os resultados do FastQC (os arquivos .html ou .zip gerados). O MultiQC irá procurar automaticamente pelos arquivos de saída do FastQC e gerar um relatório consolidado.

multiqc .

Observação: O ponto . indica que o MultiQC deve procurar pelos arquivos de resultados no diretório atual. Se seus arquivos FastQC estiverem em um subdiretório específico, você pode especificar o caminho (ex: multiqc ./fastqc_results/).

04: Visualizar o relatório MultiQC

O MultiQC gerará um arquivo chamado multiqc_report.html no diretório onde foi executado. Você precisará transferir este arquivo para o seu computador local (usando fpt ou FileZilla, por exemplo) e abri-lo em um navegador web para interagir com o relatório.

05: Interpretação dos Resultados:

Ao abrir o multiqc_report.html no seu navegador, você verá um dashboard interativo. Preste atenção nas seguintes seções:

General Statistics: Fornece um resumo de alto nível para cada amostra.
FastQC: Per Base Sequence Quality: Verifique se a qualidade das bases se mantém alta ao longo da leitura. Quedas abruptas, especialmente no final, podem indicar a necessidade de corte de reads.
FastQC: Per Sequence Quality Scores: Observe a distribuição das pontuações de qualidade médias. Idealmente, a maioria das leituras deve ter alta qualidade.
FastQC: Adapter Content: Garanta que a quantidade de adaptadores seja mínima ou ausente. A presença de adaptadores indica a necessidade de remoção (usando ferramentas como Trimmomatic).
FastQC: Sequence Duplication Levels: Níveis muito altos de duplicação podem sugerir super-amplificação por PCR e podem impactar a profundidade de cobertura real.
FastQC: Per Base GC Content: Compare o conteúdo de GC com o esperado para o organismo. Desvios podem indicar contaminação.

Os relatórios do MultiQC são interativos. Você pode clicar nas seções para expandir os gráficos, passar o mouse sobre os pontos de dados para obter mais informações e usar as opções de filtragem para visualizar subconjuntos de amostras.

Atividade 01

Considerando os 4 arquivos FASTQ analisados na prática, existe algum que você excluiria das análises subsequentes? Se sim, quais? Explique o porquê de manter ou excluir cada arquivo.
O relatório do MultiQC considera todos os arquivos FASTQC da pasta de trabalho para ser gerado. Como você faria para gerar um relatório MultiQC para os arquivos FASTQ de qualidade boa e outro para os arquivos FASTQ de qualidade ruim?

Prática II

Mon, 01 Jan 0001 00:00:00 +0000

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Nesta seção prática, vamos utilizar estratégias de bioniformática para analisar arquivos VCF.

Para isso, utilizaremos um arquivo VCF pequeno e anotado, contendo algumas variantes patogênicas e de significado incerto para fins de demonstração. Este arquivo está localizado em ~/data/variants/mgp-hg38-anno.vcf no servidor.

Objetivos:

Compreender a estrutura de um arquivo VCF (Variant Call Format).
Interpretar as informações contidas nas diferentes colunas de um VCF, incluindo genótipos e anotações.
Utilizar comandos de linha e scripts R para inspecionar e filtrar variantes.

Passo-a-passo

01: Descomprimir um Arquivo VCF e Visualizar seu Cabeçalho

Antes de tudo, vamos descomprimir o arquivo VCF de exemplo e inspecionar seu cabeçalho. O cabeçalho VCF contém metadados importantes sobre o pipeline de chamada de variantes e as ferramentas de anotação usadas.

# Navegar até o diretório das variantes

cd /home/USERNAME/Desktop/curso_de_inverno/quarta/vcf

# Descomprimir o arquivo VCF de exemplo (se for .gz)

bcftools view -O v -o mgp-hg38-anno.vcf mgp-hg38-anno.vcf.gz

# Visualizar as primeiras linhas do arquivo VCF, incluindo o cabeçalho

# As linhas com '##' são metadados, a linha com '#' define as colunas.

head -n 50 mgp-hg38-anno.vcf

02: Inspecionar o Conteúdo do VCF com `grep` e `less`

Vamos usar less para navegar pelo arquivo VCF e grep para buscar por variantes específicas ou filtrar por critérios simples.

# Visualizar o arquivo VCF completo usando less (pressione 'q' para sair)

less mgp-hg38-anno.vcf

# Procurar por variantes em um cromossomo específico (ex: chr1)

grep -P '^#|chr1\t' mgp-hg38-anno.vcf | less

# Procurar por variantes que passaram em todos os filtros (campo FILTER = PASS)

grep -P '^#|PASS\t' mgp-hg38-anno.vcf | less

# Procurar por uma variante com um ID específico (se houver, ex: rs12345)

grep -P '^#|rs12345\t' mgp-hg38-anno.vcf | less

03: Extrair e Filtrar Variantes com `bcftools`

O pacote de ferramentas bcftools é um poderoso aliado na exploração de arquivos VCF. Vamos usá-lo para extrair informações específicas e aplicar filtros. Lembre-se que ele já está instalado no servidor de aula, mas deve ser instalado em seu ambiente Linux para uso.

Sobre instalação do BCFtools.

# Contar o número total de variantes (excluindo linhas de cabeçalho)

bcftools view -H mgp-hg38-anno.vcf | wc -l

# Visualizar algumas métricas do arquivo VCF completo usando stats do bcftools, incluindo número total de variantes

bcftools stats mgp-hg38-anno.vcf > stats.txt
less stats.txt

# Filtrar variantes que são classificadas como "Pathogenic" ou "Likely Pathogenic" nas colunas de anotação 
# (exemplo de anotação ClinVar)
# NOTA: O nome exato da anotação no campo INFO ou em coluna específica pode variar dependendo da ferramenta de anotação 
# (ex: ANN, ClinVar_CLNSIG)
# Para este exemplo, usaremos uma anotação 'CLNSIG'
# -i (ou --include): Indica que você quer incluir apenas as variantes que satisfazem a condição especificada
# 

bcftools view -i 'INFO/CLNSIG="Pathogenic" | INFO/CLNSIG="Likely_pathogenic"' mgp-hg38-anno.vcf | less
bcftools view -i 'INFO/CLNSIG="Pathogenic" | INFO/CLNSIG="Likely_pathogenic"' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-pat.txt
less stats-pat.txt

bcftools view -i 'INFO/Func.refGene="exonic"' mgp-hg38-anno.vcf | less
bcftools view -i 'INFO/Func.refGene="exonic"' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-exonic.txt
less stats-exonic.txt

Atividade 02

Quantas variantes genéticas foram chamadas ao todo nas amostras do VCF? Quantas amostras foram sequenciadas no projeto?
Quantos INDELs foram encontrados no projeto? E quantos SNVs?
Qual a taxa ti/tv (transições / transversões) média entre todas as variantes?
Quantas variantes genéticas são classificadas como patogênicas?
Qual a taxa ti/tv (transições / transversões) média entre as variantes genéticas classificadas como patogênicas?

Extra

Algumas dicas extras na hora de analisar nosso VCF:

# Extrair as métricas do arquivo VCF filtrado por cromossomo (ex: chr 1)

grep -E '^#|chr1\t' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-chr1.txt
less stats-chr1.txt

# Extrair as métricas do arquivo VCF filtrado por qualidade (campo FILTER = PASS)

grep -E '^#|PASS\t' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-pass.txt
less stats-pass.txt

# Extrair as métricas do arquivo VCF filtrado por rsID (se houver, ex: rs12345)

grep -E '^#|rs12345\t' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-rsID.txt
less stats-rsID.txt

# Filtrar por SNPs e INDELs

# SNPs

bcftools view -v snps mgp-hg38-anno.vcf | less

# INDELs

bcftools view -v indels mgp-hg38-anno.vcf | less

Prática III

Mon, 01 Jan 0001 00:00:00 +0000

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Nesta seção prática, vamos criar um script R para carregar o arquivo VCF, extrair informações de anotação (especialmente o impacto funcional e a classificação de patogenicidade) e gerar gráficos.

Objetivos:

Conhecer a interface gráfica básica do RStudio e princípios da linguagem R.
Aplicar pacotes de manipulação de dados pelo R para quantificar e analisar variantes genéticas.
Gerar gráficos para apresentação de resultados.

Passo-a-passo

01: Criar script R

Abra o RStudio, copie e cole o conteúdo abaixo e salve como praticaiii (a extensão .R é automática).

library(dplyr)
library(stringr)
library(tidyr)
library(glue)
library(ggplot2)
library(scales)

### Ctrl+Shift+H
### Selecione a pasta com os arquivos da prática como seu diretório de trabalho
getwd()

### PARTE 1: ORGANIZAÇÃO DOS DADOS

# Arquivo ANNOVAR .txt ---------------------------------------------------------

vcf <- data.table::fread("mgp-hg38.txt", sep = "\t", quote = "")

# Contar os tipos de variantes quanto à região ---------------------------------

tipo_var_regiao <- as.data.frame(table(vcf$Func.refGene))

# Selecionar variantes quanto à região -----------------------------------------

filt1 <- filter(vcf, Func.refGene == "exonic")
filt2 <- filter(vcf, Func.refGene == "intronic")
filt3 <- filter(vcf, Func.refGene == "splicing")

# Contar os tipos de variantes quanto à patogenicidade -------------------------

tipo_var_patogenicidade <- as.data.frame(table(vcf$CLNSIG))

# Selecionar variantes quanto à patogenicidade ---------------------------------

filt4 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Pathogenic", "Pathogenic/Likely_pathogenic", "Pathogenic/Likely_pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance", "Pathogenic/Likely_pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance|other", "Pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance|other", "Likely_pathogenic"))
filt5 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Benign", "Benign/Likely_benign", "Likely_benign"))
filt6 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Uncertain_significance"))

### PLOTS ----------------------------------------------------------------------

### PARTE 2: VISUALIZAÇÃO DOS DADOS

### PLOT - REGIAO FUNCIONAL
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_regiao <- tipo_var_regiao %>%
 rename(Regiao = Var1, Contagem = Freq) %>%
 arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_regiao, aes(x = reorder(Regiao, -Contagem), y = Contagem)) +
 geom_bar(stat = "identity", fill = "steelblue") +
 geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
 vjust = -0.5, size = 4) +
 theme_minimal(base_size = 14) +
 labs(
 title = "Distribuição de variantes por região funcional",
 x = "Região",
 y = "Número de variantes"
 ) +
 theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
 scale_y_continuous(labels = label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig1"

### PLOT - PATOGENICIDADE
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_patogenicidade <- tipo_var_patogenicidade %>%
 rename(Patogenicidade = Var1, Contagem = Freq) %>%
 arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_patogenicidade, aes(x = reorder(Patogenicidade, -Contagem), y = Contagem)) +
 geom_bar(stat = "identity", fill = "tomato") +
 geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
 vjust = -0.5, size = 4) +
 theme_minimal(base_size = 14) +
 labs(
 title = "Distribuição de variantes por patogenicidade (CLNSIG)",
 x = "Classificação",
 y = "Número de variantes"
 ) +
 theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
 scale_y_continuous(labels = label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig2"

### PLOT - PATOGENICIDADE (excluindo não classificadas)
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_patogenicidade_filtrado <- tipo_var_patogenicidade %>%
 filter(!is.na(Patogenicidade) & Patogenicidade != ".") %>%
 arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_patogenicidade_filtrado, aes(x = reorder(Patogenicidade, -Contagem), y = Contagem)) +
 geom_bar(stat = "identity", fill = "tomato") +
 geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
 vjust = -0.5, size = 4) +
 theme_minimal(base_size = 14) +
 labs(
 title = "Distribuição de variantes por patogenicidade (CLNSIG - somente classificadas)",
 x = "Classificação",
 y = "Número de variantes"
 ) +
 theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
 scale_y_continuous(labels = scales::label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig3"

### EXCEL ----------------------------------------------------------------------

### PARTE 3: EXPLORAÇÃO DOS BANCOS DE DADOS PÚBLICOS

# Salvar o objeto filt4 como tabela .xlsx
writexl::write_xlsx(filt4, "variantes_patogenicas.xlsx")

02: Executar o software RStudio na interface gráfica X2GO

Agora podemos trabalhar com o script em R.

Executar linha por linha

Para executar uma linha ou uma seleção do script:
- Clique na linha desejada (ou selecione o trecho).
- Pressione Ctrl + Enter (ou Cmd + Enter no Mac).
- O comando será executado no Console, que fica no painel inferior esquerdo.

Atividade 03

Considerando a classificação de posição funcional das variantes genéticas no genoma, qual o tipo de variante genética mais abundante entre as amostras sequenciadas?
E quanto à classificação de patogenicidade, qual o tipo de variante genética mais abundante?
Escolha uma variante genética classificada como patogênica e explore suas características no Ensembl e no UCSC Genome Browser. Lembre-se, todas as variantes genéticas conhecidas possuem rsID no dbSNP.

v1.0.0 - Datasets Curso Genômica Humana - Julho/2025

Tue, 01 Jul 2025 00:00:00 +0000

Arquivos para Atividade 01

Arquivos para Atividade 02 e 03

Referências

Mon, 01 Jan 0001 00:00:00 +0000

Abaixo estão alguns links úteis para quem tem curiosidade em Bioinformática e Ciência de Dados.

Visualização de Dados

Ciência de Dados, Estatística e Aprendizado de Máquina

Bioinformática

Awesome Bioinf - A guide to almost everything in Bioinf

Análise de Dados de Sequenciamento de Exoma Completo

Sequenciamento de Nova Geração

A Gentle Intro to NGS
Another intro for NGS
And… another
RNAseq Workflow
Diff Expression
- Tutorial apresentado no PEB2020
Michael Love Tutorials
- Muito bom.

Curso de Genômica Humana | ICC Fiocruz

Revisão teórica

Controle de Qualidade Pré-mapeamento

Arquivos FASTQ

Estrutura de um arquivo FASTQ

FastQC

MultiQC

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Depois do FASTQ […] Antes do VCF

Arquivo VCF

Colunas Essenciais do formato VCF

Interpretação dos Genótipos

Campo INFO

Anotadores

Visualizando dados com a linguagem R

O que é a Linguagem R?

Por que R na Bioinformática?

O que é RStudio?

Programação com Pacotes em R

Próximo passo

Prática I

Análise de arquivos FASTQ

Passo-a-passo

01: Navegar até o diretório dos arquivos FASTQ

02: Executar FastQC para cada arquivo FASTQ

03: Executar MultiQC para consolidar os relatórios

04: Visualizar o relatório MultiQC

05: Interpretação dos Resultados:

Atividade 01

Prática II

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Passo-a-passo

01: Descomprimir um Arquivo VCF e Visualizar seu Cabeçalho

02: Inspecionar o Conteúdo do VCF com grep e less

03: Extrair e Filtrar Variantes com bcftools

Atividade 02

Extra

Prática III

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Passo-a-passo

01: Criar script R

02: Executar o software RStudio na interface gráfica X2GO

Executar linha por linha

Atividade 03

v1.0.0 - Datasets Curso Genômica Humana - Julho/2025

Arquivos para Atividade 01

Arquivos para Atividade 02 e 03

Referências

Visualização de Dados

Ciência de Dados, Estatística e Aprendizado de Máquina

Bioinformática

Análise de Dados de Sequenciamento de Exoma Completo

Sequenciamento de Nova Geração

R

Tidy*

Markdown

Shiny

02: Inspecionar o Conteúdo do VCF com `grep` e `less`

03: Extrair e Filtrar Variantes com `bcftools`