Prática III | ICC Fiocruz

Prática III

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Nesta seção prática, vamos criar um script R para carregar o arquivo VCF, extrair informações de anotação (especialmente o impacto funcional e a classificação de patogenicidade) e gerar gráficos.

Objetivos:

Conhecer a interface gráfica básica do RStudio e princípios da linguagem R.
Aplicar pacotes de manipulação de dados pelo R para quantificar e analisar variantes genéticas.
Gerar gráficos para apresentação de resultados.

Passo-a-passo

01: Criar script R

Abra o RStudio, copie e cole o conteúdo abaixo e salve como praticaiii (a extensão .R é automática).

library(dplyr)
library(stringr)
library(tidyr)
library(glue)
library(ggplot2)
library(scales)

### Ctrl+Shift+H
### Selecione a pasta com os arquivos da prática como seu diretório de trabalho
getwd()

### PARTE 1: ORGANIZAÇÃO DOS DADOS

# Arquivo ANNOVAR .txt ---------------------------------------------------------

vcf <- data.table::fread("mgp-hg38.txt", sep = "\t", quote = "")

# Contar os tipos de variantes quanto à região ---------------------------------

tipo_var_regiao <- as.data.frame(table(vcf$Func.refGene))

# Selecionar variantes quanto à região -----------------------------------------

filt1 <- filter(vcf, Func.refGene == "exonic")
filt2 <- filter(vcf, Func.refGene == "intronic")
filt3 <- filter(vcf, Func.refGene == "splicing")

# Contar os tipos de variantes quanto à patogenicidade -------------------------

tipo_var_patogenicidade <- as.data.frame(table(vcf$CLNSIG))

# Selecionar variantes quanto à patogenicidade ---------------------------------

filt4 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Pathogenic", "Pathogenic/Likely_pathogenic", "Pathogenic/Likely_pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance", "Pathogenic/Likely_pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance|other", "Pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance|other", "Likely_pathogenic"))
filt5 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Benign", "Benign/Likely_benign", "Likely_benign"))
filt6 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Uncertain_significance"))

### PLOTS ----------------------------------------------------------------------

### PARTE 2: VISUALIZAÇÃO DOS DADOS

### PLOT - REGIAO FUNCIONAL
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_regiao <- tipo_var_regiao %>%
  rename(Regiao = Var1, Contagem = Freq) %>%
  arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_regiao, aes(x = reorder(Regiao, -Contagem), y = Contagem)) +
  geom_bar(stat = "identity", fill = "steelblue") +
  geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
            vjust = -0.5, size = 4) +
  theme_minimal(base_size = 14) +
  labs(
    title = "Distribuição de variantes por região funcional",
    x = "Região",
    y = "Número de variantes"
  ) +
  theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
  scale_y_continuous(labels = label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig1"

### PLOT - PATOGENICIDADE
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_patogenicidade <- tipo_var_patogenicidade %>%
  rename(Patogenicidade = Var1, Contagem = Freq) %>%
  arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_patogenicidade, aes(x = reorder(Patogenicidade, -Contagem), y = Contagem)) +
  geom_bar(stat = "identity", fill = "tomato") +
  geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
            vjust = -0.5, size = 4) +
  theme_minimal(base_size = 14) +
  labs(
    title = "Distribuição de variantes por patogenicidade (CLNSIG)",
    x = "Classificação",
    y = "Número de variantes"
  ) +
  theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
  scale_y_continuous(labels = label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig2"

### PLOT - PATOGENICIDADE (excluindo não classificadas)
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_patogenicidade_filtrado <- tipo_var_patogenicidade %>%
  filter(!is.na(Patogenicidade) & Patogenicidade != ".") %>%
  arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_patogenicidade_filtrado, aes(x = reorder(Patogenicidade, -Contagem), y = Contagem)) +
  geom_bar(stat = "identity", fill = "tomato") +
  geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
            vjust = -0.5, size = 4) +
  theme_minimal(base_size = 14) +
  labs(
    title = "Distribuição de variantes por patogenicidade (CLNSIG - somente classificadas)",
    x = "Classificação",
    y = "Número de variantes"
  ) +
  theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
  scale_y_continuous(labels = scales::label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig3"

### EXCEL ----------------------------------------------------------------------

### PARTE 3: EXPLORAÇÃO DOS BANCOS DE DADOS PÚBLICOS

# Salvar o objeto filt4 como tabela .xlsx
writexl::write_xlsx(filt4, "variantes_patogenicas.xlsx")

02: Executar o software RStudio na interface gráfica X2GO

Agora podemos trabalhar com o script em R.

Executar linha por linha

Para executar uma linha ou uma seleção do script:
- Clique na linha desejada (ou selecione o trecho).
- Pressione Ctrl + Enter (ou Cmd + Enter no Mac).
- O comando será executado no Console, que fica no painel inferior esquerdo.

Atividade 03

Considerando a classificação de posição funcional das variantes genéticas no genoma, qual o tipo de variante genética mais abundante entre as amostras sequenciadas?
E quanto à classificação de patogenicidade, qual o tipo de variante genética mais abundante?
Escolha uma variante genética classificada como patogênica e explore suas características no Ensembl e no UCSC Genome Browser. Lembre-se, todas as variantes genéticas conhecidas possuem rsID no dbSNP.

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