Práticas
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Prática I

Prática I

Análise de arquivos FASTQ

Nesta seção prática, vamos utilizar as ferramentas FastQC e MultiQC para analisar a qualidade de arquivos FASTQ de exemplo.

Os arquivos FASTQ estão localizados no diretório ~/data/fastq/ no servidor.

Objetivos:

  • Gerar relatórios de qualidade para arquivos FASTQ individuais usando FastQC.
  • Consolidar múltiplos relatórios FastQC em um único relatório interativo usando MultiQC.
  • Interpretar os resultados para identificar potenciais problemas de qualidade.

Passo-a-passo

01: Navegar até o diretório dos arquivos FASTQ

Primeiro, acesse o diretório onde seus arquivos FASTQ estão armazenados.

cd /home/USERNAME/Desktop/curso_de_inverno/quarta/fastq

02: Executar FastQC para cada arquivo FASTQ

Para cada arquivo FASTQ, execute o FastQC individualmente. O FastQC criará um arquivo .html e um arquivo .zip para cada FASTQ no mesmo diretório.

fastqc Exoma001.fastq.gz

fastqc Exoma002.fastq.gz

# Repita para todos os arquivos FASTQ que você deseja analisar!

03: Executar MultiQC para consolidar os relatórios

Após executar o FastQC para todos os seus arquivos, execute o MultiQC no diretório que contém os resultados do FastQC (os arquivos .html ou .zip gerados). O MultiQC irá procurar automaticamente pelos arquivos de saída do FastQC e gerar um relatório consolidado.

multiqc .
  • Observação: O ponto . indica que o MultiQC deve procurar pelos arquivos de resultados no diretório atual. Se seus arquivos FastQC estiverem em um subdiretório específico, você pode especificar o caminho (ex: multiqc ./fastqc_results/).

04: Visualizar o relatório MultiQC

O MultiQC gerará um arquivo chamado multiqc_report.html no diretório onde foi executado. Você precisará transferir este arquivo para o seu computador local (usando fpt ou FileZilla, por exemplo) e abri-lo em um navegador web para interagir com o relatório.

05: Interpretação dos Resultados:

Ao abrir o multiqc_report.html no seu navegador, você verá um dashboard interativo. Preste atenção nas seguintes seções:

  • General Statistics: Fornece um resumo de alto nível para cada amostra.

  • FastQC: Per Base Sequence Quality: Verifique se a qualidade das bases se mantém alta ao longo da leitura. Quedas abruptas, especialmente no final, podem indicar a necessidade de corte de reads.

  • FastQC: Per Sequence Quality Scores: Observe a distribuição das pontuações de qualidade médias. Idealmente, a maioria das leituras deve ter alta qualidade.

  • FastQC: Adapter Content: Garanta que a quantidade de adaptadores seja mínima ou ausente. A presença de adaptadores indica a necessidade de remoção (usando ferramentas como Trimmomatic).

  • FastQC: Sequence Duplication Levels: Níveis muito altos de duplicação podem sugerir super-amplificação por PCR e podem impactar a profundidade de cobertura real.

  • FastQC: Per Base GC Content: Compare o conteúdo de GC com o esperado para o organismo. Desvios podem indicar contaminação.

Os relatórios do MultiQC são interativos. Você pode clicar nas seções para expandir os gráficos, passar o mouse sobre os pontos de dados para obter mais informações e usar as opções de filtragem para visualizar subconjuntos de amostras.

Atividade 01

  • Considerando os 4 arquivos FASTQ analisados na prática, existe algum que você excluiria das análises subsequentes? Se sim, quais? Explique o porquê de manter ou excluir cada arquivo.

  • O relatório do MultiQC considera todos os arquivos FASTQC da pasta de trabalho para ser gerado. Como você faria para gerar um relatório MultiQC para os arquivos FASTQ de qualidade boa e outro para os arquivos FASTQ de qualidade ruim?