Mão na massa! | ICC Fiocruz

Prática I

Mon, 01 Jan 0001 00:00:00 +0000

Análise de arquivos FASTQ

Nesta seção prática, vamos utilizar as ferramentas FastQC e MultiQC para analisar a qualidade de arquivos FASTQ de exemplo.

Os arquivos FASTQ estão localizados no diretório ~/data/fastq/ no servidor.

Objetivos:

Gerar relatórios de qualidade para arquivos FASTQ individuais usando FastQC.
Consolidar múltiplos relatórios FastQC em um único relatório interativo usando MultiQC.
Interpretar os resultados para identificar potenciais problemas de qualidade.

Passo-a-passo

01: Navegar até o diretório dos arquivos FASTQ

Primeiro, acesse o diretório onde seus arquivos FASTQ estão armazenados.

cd /home/USERNAME/Desktop/curso_de_inverno/quarta/fastq

02: Executar FastQC para cada arquivo FASTQ

Para cada arquivo FASTQ, execute o FastQC individualmente. O FastQC criará um arquivo .html e um arquivo .zip para cada FASTQ no mesmo diretório.

fastqc Exoma001.fastq.gz

fastqc Exoma002.fastq.gz

# Repita para todos os arquivos FASTQ que você deseja analisar!

03: Executar MultiQC para consolidar os relatórios

Após executar o FastQC para todos os seus arquivos, execute o MultiQC no diretório que contém os resultados do FastQC (os arquivos .html ou .zip gerados). O MultiQC irá procurar automaticamente pelos arquivos de saída do FastQC e gerar um relatório consolidado.

multiqc .

Observação: O ponto . indica que o MultiQC deve procurar pelos arquivos de resultados no diretório atual. Se seus arquivos FastQC estiverem em um subdiretório específico, você pode especificar o caminho (ex: multiqc ./fastqc_results/).

04: Visualizar o relatório MultiQC

O MultiQC gerará um arquivo chamado multiqc_report.html no diretório onde foi executado. Você precisará transferir este arquivo para o seu computador local (usando fpt ou FileZilla, por exemplo) e abri-lo em um navegador web para interagir com o relatório.

05: Interpretação dos Resultados:

Ao abrir o multiqc_report.html no seu navegador, você verá um dashboard interativo. Preste atenção nas seguintes seções:

General Statistics: Fornece um resumo de alto nível para cada amostra.
FastQC: Per Base Sequence Quality: Verifique se a qualidade das bases se mantém alta ao longo da leitura. Quedas abruptas, especialmente no final, podem indicar a necessidade de corte de reads.
FastQC: Per Sequence Quality Scores: Observe a distribuição das pontuações de qualidade médias. Idealmente, a maioria das leituras deve ter alta qualidade.
FastQC: Adapter Content: Garanta que a quantidade de adaptadores seja mínima ou ausente. A presença de adaptadores indica a necessidade de remoção (usando ferramentas como Trimmomatic).
FastQC: Sequence Duplication Levels: Níveis muito altos de duplicação podem sugerir super-amplificação por PCR e podem impactar a profundidade de cobertura real.
FastQC: Per Base GC Content: Compare o conteúdo de GC com o esperado para o organismo. Desvios podem indicar contaminação.

Os relatórios do MultiQC são interativos. Você pode clicar nas seções para expandir os gráficos, passar o mouse sobre os pontos de dados para obter mais informações e usar as opções de filtragem para visualizar subconjuntos de amostras.

Atividade 01

Considerando os 4 arquivos FASTQ analisados na prática, existe algum que você excluiria das análises subsequentes? Se sim, quais? Explique o porquê de manter ou excluir cada arquivo.
O relatório do MultiQC considera todos os arquivos FASTQC da pasta de trabalho para ser gerado. Como você faria para gerar um relatório MultiQC para os arquivos FASTQ de qualidade boa e outro para os arquivos FASTQ de qualidade ruim?

Prática II

Mon, 01 Jan 0001 00:00:00 +0000

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Nesta seção prática, vamos utilizar estratégias de bioniformática para analisar arquivos VCF.

Para isso, utilizaremos um arquivo VCF pequeno e anotado, contendo algumas variantes patogênicas e de significado incerto para fins de demonstração. Este arquivo está localizado em ~/data/variants/mgp-hg38-anno.vcf no servidor.

Objetivos:

Compreender a estrutura de um arquivo VCF (Variant Call Format).
Interpretar as informações contidas nas diferentes colunas de um VCF, incluindo genótipos e anotações.
Utilizar comandos de linha e scripts R para inspecionar e filtrar variantes.

Passo-a-passo

01: Descomprimir um Arquivo VCF e Visualizar seu Cabeçalho

Antes de tudo, vamos descomprimir o arquivo VCF de exemplo e inspecionar seu cabeçalho. O cabeçalho VCF contém metadados importantes sobre o pipeline de chamada de variantes e as ferramentas de anotação usadas.

# Navegar até o diretório das variantes

cd /home/USERNAME/Desktop/curso_de_inverno/quarta/vcf

# Descomprimir o arquivo VCF de exemplo (se for .gz)

bcftools view -O v -o mgp-hg38-anno.vcf mgp-hg38-anno.vcf.gz

# Visualizar as primeiras linhas do arquivo VCF, incluindo o cabeçalho

# As linhas com '##' são metadados, a linha com '#' define as colunas.

head -n 50 mgp-hg38-anno.vcf

02: Inspecionar o Conteúdo do VCF com `grep` e `less`

Vamos usar less para navegar pelo arquivo VCF e grep para buscar por variantes específicas ou filtrar por critérios simples.

# Visualizar o arquivo VCF completo usando less (pressione 'q' para sair)

less mgp-hg38-anno.vcf

# Procurar por variantes em um cromossomo específico (ex: chr1)

grep -P '^#|chr1\t' mgp-hg38-anno.vcf | less

# Procurar por variantes que passaram em todos os filtros (campo FILTER = PASS)

grep -P '^#|PASS\t' mgp-hg38-anno.vcf | less

# Procurar por uma variante com um ID específico (se houver, ex: rs12345)

grep -P '^#|rs12345\t' mgp-hg38-anno.vcf | less

03: Extrair e Filtrar Variantes com `bcftools`

O pacote de ferramentas bcftools é um poderoso aliado na exploração de arquivos VCF. Vamos usá-lo para extrair informações específicas e aplicar filtros. Lembre-se que ele já está instalado no servidor de aula, mas deve ser instalado em seu ambiente Linux para uso.

Sobre instalação do BCFtools.

# Contar o número total de variantes (excluindo linhas de cabeçalho)

bcftools view -H mgp-hg38-anno.vcf | wc -l

# Visualizar algumas métricas do arquivo VCF completo usando stats do bcftools, incluindo número total de variantes

bcftools stats mgp-hg38-anno.vcf > stats.txt
less stats.txt

# Filtrar variantes que são classificadas como "Pathogenic" ou "Likely Pathogenic" nas colunas de anotação 
# (exemplo de anotação ClinVar)
# NOTA: O nome exato da anotação no campo INFO ou em coluna específica pode variar dependendo da ferramenta de anotação 
# (ex: ANN, ClinVar_CLNSIG)
# Para este exemplo, usaremos uma anotação 'CLNSIG'
# -i (ou --include): Indica que você quer incluir apenas as variantes que satisfazem a condição especificada
# 

bcftools view -i 'INFO/CLNSIG="Pathogenic" | INFO/CLNSIG="Likely_pathogenic"' mgp-hg38-anno.vcf | less
bcftools view -i 'INFO/CLNSIG="Pathogenic" | INFO/CLNSIG="Likely_pathogenic"' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-pat.txt
less stats-pat.txt

bcftools view -i 'INFO/Func.refGene="exonic"' mgp-hg38-anno.vcf | less
bcftools view -i 'INFO/Func.refGene="exonic"' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-exonic.txt
less stats-exonic.txt

Atividade 02

Quantas variantes genéticas foram chamadas ao todo nas amostras do VCF? Quantas amostras foram sequenciadas no projeto?
Quantos INDELs foram encontrados no projeto? E quantos SNVs?
Qual a taxa ti/tv (transições / transversões) média entre todas as variantes?
Quantas variantes genéticas são classificadas como patogênicas?
Qual a taxa ti/tv (transições / transversões) média entre as variantes genéticas classificadas como patogênicas?

Extra

Algumas dicas extras na hora de analisar nosso VCF:

# Extrair as métricas do arquivo VCF filtrado por cromossomo (ex: chr 1)

grep -E '^#|chr1\t' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-chr1.txt
less stats-chr1.txt

# Extrair as métricas do arquivo VCF filtrado por qualidade (campo FILTER = PASS)

grep -E '^#|PASS\t' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-pass.txt
less stats-pass.txt

# Extrair as métricas do arquivo VCF filtrado por rsID (se houver, ex: rs12345)

grep -E '^#|rs12345\t' mgp-hg38-anno.vcf | bcftools stats > stats-rsID.txt
less stats-rsID.txt

# Filtrar por SNPs e INDELs

# SNPs

bcftools view -v snps mgp-hg38-anno.vcf | less

# INDELs

bcftools view -v indels mgp-hg38-anno.vcf | less

Prática III

Mon, 01 Jan 0001 00:00:00 +0000

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Nesta seção prática, vamos criar um script R para carregar o arquivo VCF, extrair informações de anotação (especialmente o impacto funcional e a classificação de patogenicidade) e gerar gráficos.

Objetivos:

Conhecer a interface gráfica básica do RStudio e princípios da linguagem R.
Aplicar pacotes de manipulação de dados pelo R para quantificar e analisar variantes genéticas.
Gerar gráficos para apresentação de resultados.

Passo-a-passo

01: Criar script R

Abra o RStudio, copie e cole o conteúdo abaixo e salve como praticaiii (a extensão .R é automática).

library(dplyr)
library(stringr)
library(tidyr)
library(glue)
library(ggplot2)
library(scales)

### Ctrl+Shift+H
### Selecione a pasta com os arquivos da prática como seu diretório de trabalho
getwd()

### PARTE 1: ORGANIZAÇÃO DOS DADOS

# Arquivo ANNOVAR .txt ---------------------------------------------------------

vcf <- data.table::fread("mgp-hg38.txt", sep = "\t", quote = "")

# Contar os tipos de variantes quanto à região ---------------------------------

tipo_var_regiao <- as.data.frame(table(vcf$Func.refGene))

# Selecionar variantes quanto à região -----------------------------------------

filt1 <- filter(vcf, Func.refGene == "exonic")
filt2 <- filter(vcf, Func.refGene == "intronic")
filt3 <- filter(vcf, Func.refGene == "splicing")

# Contar os tipos de variantes quanto à patogenicidade -------------------------

tipo_var_patogenicidade <- as.data.frame(table(vcf$CLNSIG))

# Selecionar variantes quanto à patogenicidade ---------------------------------

filt4 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Pathogenic", "Pathogenic/Likely_pathogenic", "Pathogenic/Likely_pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance", "Pathogenic/Likely_pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance|other", "Pathogenic/Pathogenic,_low_penetrance|other", "Likely_pathogenic"))
filt5 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Benign", "Benign/Likely_benign", "Likely_benign"))
filt6 <- filter(vcf, CLNSIG %in% c("Uncertain_significance"))

### PLOTS ----------------------------------------------------------------------

### PARTE 2: VISUALIZAÇÃO DOS DADOS

### PLOT - REGIAO FUNCIONAL
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_regiao <- tipo_var_regiao %>%
 rename(Regiao = Var1, Contagem = Freq) %>%
 arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_regiao, aes(x = reorder(Regiao, -Contagem), y = Contagem)) +
 geom_bar(stat = "identity", fill = "steelblue") +
 geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
 vjust = -0.5, size = 4) +
 theme_minimal(base_size = 14) +
 labs(
 title = "Distribuição de variantes por região funcional",
 x = "Região",
 y = "Número de variantes"
 ) +
 theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
 scale_y_continuous(labels = label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig1"

### PLOT - PATOGENICIDADE
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_patogenicidade <- tipo_var_patogenicidade %>%
 rename(Patogenicidade = Var1, Contagem = Freq) %>%
 arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_patogenicidade, aes(x = reorder(Patogenicidade, -Contagem), y = Contagem)) +
 geom_bar(stat = "identity", fill = "tomato") +
 geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
 vjust = -0.5, size = 4) +
 theme_minimal(base_size = 14) +
 labs(
 title = "Distribuição de variantes por patogenicidade (CLNSIG)",
 x = "Classificação",
 y = "Número de variantes"
 ) +
 theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
 scale_y_continuous(labels = label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig2"

### PLOT - PATOGENICIDADE (excluindo não classificadas)
# Garantir que os dados estão organizados
tipo_var_patogenicidade_filtrado <- tipo_var_patogenicidade %>%
 filter(!is.na(Patogenicidade) & Patogenicidade != ".") %>%
 arrange(desc(Contagem))

# Criar gráfico de barras
ggplot(tipo_var_patogenicidade_filtrado, aes(x = reorder(Patogenicidade, -Contagem), y = Contagem)) +
 geom_bar(stat = "identity", fill = "tomato") +
 geom_text(aes(label = format(Contagem, big.mark = ".", decimal.mark = ",")), 
 vjust = -0.5, size = 4) +
 theme_minimal(base_size = 14) +
 labs(
 title = "Distribuição de variantes por patogenicidade (CLNSIG - somente classificadas)",
 x = "Classificação",
 y = "Número de variantes"
 ) +
 theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1)) +
 scale_y_continuous(labels = scales::label_number(big.mark = ".", decimal.mark = ","))
### DÊ ZOOM E SALVE O GRÁFICO COMO "fig3"

### EXCEL ----------------------------------------------------------------------

### PARTE 3: EXPLORAÇÃO DOS BANCOS DE DADOS PÚBLICOS

# Salvar o objeto filt4 como tabela .xlsx
writexl::write_xlsx(filt4, "variantes_patogenicas.xlsx")

02: Executar o software RStudio na interface gráfica X2GO

Agora podemos trabalhar com o script em R.

Executar linha por linha

Para executar uma linha ou uma seleção do script:
- Clique na linha desejada (ou selecione o trecho).
- Pressione Ctrl + Enter (ou Cmd + Enter no Mac).
- O comando será executado no Console, que fica no painel inferior esquerdo.

Atividade 03

Considerando a classificação de posição funcional das variantes genéticas no genoma, qual o tipo de variante genética mais abundante entre as amostras sequenciadas?
E quanto à classificação de patogenicidade, qual o tipo de variante genética mais abundante?
Escolha uma variante genética classificada como patogênica e explore suas características no Ensembl e no UCSC Genome Browser. Lembre-se, todas as variantes genéticas conhecidas possuem rsID no dbSNP.

Mão na massa! | ICC Fiocruz

Prática I

Análise de arquivos FASTQ

Passo-a-passo

01: Navegar até o diretório dos arquivos FASTQ

02: Executar FastQC para cada arquivo FASTQ

03: Executar MultiQC para consolidar os relatórios

04: Visualizar o relatório MultiQC

05: Interpretação dos Resultados:

Atividade 01

Prática II

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Passo-a-passo

01: Descomprimir um Arquivo VCF e Visualizar seu Cabeçalho

02: Inspecionar o Conteúdo do VCF com grep e less

03: Extrair e Filtrar Variantes com bcftools

Atividade 02

Extra

Prática III

Explorando e Interpretando Arquivos VCF

Passo-a-passo

01: Criar script R

02: Executar o software RStudio na interface gráfica X2GO

Executar linha por linha

Atividade 03

02: Inspecionar o Conteúdo do VCF com `grep` e `less`

03: Extrair e Filtrar Variantes com `bcftools`